摘要

对于卵子质量差的患者治疗是当今辅助生殖领域面临的巨大挑战之一。卵胞质移植（ooplasmic transfer，OT）的应用旨在为卵子质量差导致反复移植失败的患者提高胚胎发育潜能。该技术通过移植少量的有益供体卵胞质，纠正受体卵母细胞的缺陷，帮助其恢复正常的发育能力。本文对OT过程中，重构胚的线粒体功能、线粒体DNA异质性、细胞凋亡的调节、细胞分裂、表观遗传修饰、卵胞质内容物、mRNA等因素产生变化的机制进行综述，并对OT技术在辅助生育应用中的优势及弊端进行总结。


【关键词】卵胞质移植；线粒体；卵胞质内容物；凋亡；表观遗传修饰；辅助生殖

基金项目：广州市卫生健康科技项目（20191A011027）；中华医学会临床医学科研专项基金（18010210750）

DOI: 10.3760/cma.j.cn101441-20190905-00404.

 

卵胞质移植（ooplasmic transfer， OT）技术是通过电融合法或显微注射法，将供体卵母细胞的部分细胞质移植到受体卵母细胞内，以期改善辅助生育过程中卵母细胞质量差的问题，帮助发育阻滞的卵母细胞或胚胎恢复正常的受精和发育能力［1］。OT技术的出现促使学者们更加深入的探究卵胞质对受精和胚胎发育的影响。目前为止，OT如何恢复和改善胚胎发育的具体机制尚未完全阐明。与此同时，OT是否也将不利的因子带入受体卵母细胞内，从而影响后续的胚胎发育？本文对OT技术在辅助生育应用中的优势及弊端进行综述。


一.OT在临床中的应用


1982年，Muggleton-Harris等［2］首次报道小鼠卵胞质异体移植能有效克服2-细胞阶段的发育阻滞。此后，涌现出诸多采用OT技术以期解决卵胞质或胚胎缺陷的研究报道。1997年，Cohen等［3］报道OT已经成功应用在反复种植失败、胚胎发育差的患者中，并获得妊娠和出生婴孩。除了研究同步OT（MII到MII）的安全性和效能，学者们还探究不同步移植的可能性，研究结果显示，采用冷冻卵子或3原核合子的OT，也均可取得良好的效果，供体和受体之间不需要严格的同步化处理［4］。OT采用的供体卵胞质大多数为异体卵胞质，该技术带入异质性线粒体的问题至今仍被关注。母源基因组和外源卵胞质是否存在不相容性，最终导致基因表达紊乱和发育不良？而来自供体细胞少量的线粒体DNA（mitochondrial DNA， mtDNA）可与卵母细胞的mtDNA在重构胚中共存，在后代体内持久存在，说明卵母细胞和胚胎对供体线粒体又存在一定的兼容性［5］。


线粒体是高度异质性的，它的功能由核基因以及线粒体基因共同控制，使得正常个体中，自体的mtDNA也存在异质性。与此同时，mtDNA的突变概率约为1∶5000，当这些变异累积超过某一阈值时（30%~85%），才会导致下一代患病［6］。Ferreira等［7］通过电波图跟踪供体mtDNA，结果显示，与它最初的注入量相比，供体mtDNA在受体内转录及表达量明显减少。也许外源移植的mtDNA在受体的各个阶段（胚胎发育、成年）中，由于随机漂移、选择性复制的劣势而丢失了。Sharpley等［8］研究证实，通过OT导致受体获得线粒体病的概率是极其低的，约为1∶8000，所以理论上由于供体移植导致新的线粒体病，不大可能发生。这些研究均证实OT具有可行性，即便移植一定数量的外源性mtDNA，也不会影响受体卵母细胞活力。


而自体胞质移植，供体和受体的遗传物质一致，规避了异体胞质移植带来的“三亲”伦理问题。学者们开始探究反复助孕失败的患者自体胞质移植的可能性。文献报道多局限于线粒体移植，自体来源主要为两类：颗粒细胞和卵原前体细胞。然而，由于线粒体在卵母细胞（存在未分化）和颗粒细胞（分化）中的分化状态不同，颗粒细胞并不是最适合分离线粒体的细胞类型［9］。Oktay等［10］通过腹腔镜获取卵巢皮质，采用单克隆抗体anti-DDX及荧光激活筛选卵原细胞，离心后最终获得自体线粒体。由于卵原前体细胞的获取需要采取有创的手术方式获取卵巢组织，这种方法并不是很理想。方丛等［11］从自体骨髓间充质干细胞提取线粒体，注射到卵母细胞内，获得男婴活产1例，该细胞类型具有已获得且再生能力强的优势，为治疗卵母细胞质量差的患者提供了一种新的潜在方案。


OT可能会给子代带来即时或长期的健康隐患，此外，该技术也存在正常染色体和非正常染色体胞质混合的可能，目前仍需慎重考虑其应用的安全性。Barritt等［4］团队对33例由于胚胎发育差导致反复体外受精（IVF）失败的病例进行了OT实验。其中3例采用的是电融合法，该方法原核形成率低，改善胚胎发育效果差。另外30例病例采用的是显微注射法，截止至文章发表时，妊娠结局为1例流产，10例单胎，1例双胎，1例四胞胎，1例正在妊娠的单胎。显微注射法中成功妊娠的双胎产前诊断结果：一胎为45， X（终止妊娠），另外一胎为46， XX。采用显微注射法行OT成功妊娠的17例胚胎中，异常染色体的比例是1/17（5.9%），比正常人群（1%~6%）稍稍高一些，也许与卵胞质内单精子注射 （ICSI） 的应用（性染色体异常增高）及孕妇高龄有关。Chen等［12］对1996—2001年期间以反复种植失败为指征进行OT治疗的33对夫妇（13对夫妇成功生育17个孩子）进行了长期随访。除了1对夫妇失访，剩余的12对夫妇配合完成了这群孩子（13~18岁）的调查。报道显示，这些孩子身体大致健康，智力正常，但有些孩子伴有轻微的皮肤问题、轻度视觉障碍、轻度哮喘或慢性偏头痛。由于病例数少，调查结果可能存在偏倚的局限性。


二.OT的机制和影响


通过移植少量卵胞质（5%~15%）给予质量差的卵母细胞补给部分的蛋白质、线粒体、mRNA、大量的生产因子以及其它一些重要的细胞器，这些物质似乎能纠正某些至今仍不明了的卵胞质缺陷，使受体的细胞分裂、细胞凋亡的调节和线粒体功能等方面得以改善，从而在反复种植失败、胚胎发育差的患者中提高胚胎发育潜能和获得良好妊娠结局。


1.卵胞质内容物：母源至受精卵基因表达过渡阶段（maternal-to-zygotic transition， MZT），早期胚胎发育主要靠卵母细胞胞质中储存的母源物质所维持。卵母细胞的胞质质量，决定了胚胎发育的前景。人类卵母细胞存在极化的现象，期间伴随着一些因子的转移，例如，生长因子b2、血管内皮生长因子、细胞凋亡相关蛋白（Bcl-x、Bax），生长因子受体（c-kit受体、表皮生长因子受体）等［13］。将供体少量卵胞质显微注射到受体时，注射点的选择很重要。如果注入点是极化的区域，可能会改变调节早期胚胎发育的极化蛋白，影响后续的胚胎发育。OT是否也将不利的因子带入，影响后续的胚胎发育？Gonzalez-Grajales等［14］为了解答这个问题，观察OT重构野牛胚胎8~16-细胞时的状态，没有检测到核呼吸因子2（NRF2）、线粒体转录因子A（TFAM）和线粒体细胞色素氧化酶C亚单位2（COX2）的表达发生显著改变。


2.细胞分裂：OT可以改善质量差卵子形成纺锤体的能力，从而促进合子形成。卵胞质动力微管紧密相连的两种主要蛋白，分别为分裂相关蛋白激酶（mitogen-associated protein kinase，MAPK）及M期细胞促进因子（M-phase promoting factor，MPF）。MAPK作为丝氨酸/苏氨酸特异蛋白激酶，直接应对各种细胞调节。MPF参与生发泡破裂，染色体浓缩以及纺锤体结构的调控［15］。成熟的MII卵母细胞包含MPF和细胞生长抑制因子（cytostatic factor，CSF）。CSF出现在成熟的卵胞质内，起到稳定MPF的作用，但在卵子激活时消失。研究表明，在未受精的卵子中存在一定量的CSF，它可导致受精后胚胎的发育阻滞［16］。高龄患者的卵子在减数分裂中形成纺锤体的能力有所下降，OT可以动态地增加卵胞质微管、细胞周期因子，从而利于受体卵母细胞形成具有动力的纺锤体。但需要注意的是，减数分裂I期和II期的纺锤体容易被显微注射针干扰，会增加染色体异常的可能［17］。


3.细胞凋亡的调节：不论自然受精还是体外受精，植入前胚胎发育离不开细胞凋亡的调节。促进凋亡基因（Bax）和抑制凋亡基因（Bcl-2）调控细胞凋亡的平衡，帮助发育中的胚胎移除有缺陷的细胞［18］。成熟的卵子具备足够抑制凋亡的mRNA，这类卵子质量较好并容易受精；而质量差的卵子，由于细胞凋亡的加剧，或者抑制凋亡的因子减少，最终导致胚胎碎片多、发育阻滞。


哺乳动物卵母细胞和植入前胚胎的促进和抑制凋亡作用因子分别有神经酰胺和1-磷酸-鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate， S1P）。在人类植入前胚胎发育过程中，细胞色素C和凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor， AIF）是具备氧化还原及调节细胞凋亡双功能的蛋白，通常通过改变膜的不对称性和暴露丝氨酸磷脂激发半胱天冬酶级联反应，从而主导细胞凋亡的调节［19］。研究提示，健康的供体卵胞质为高龄、胚胎质量差的患者提供了特异的、利于抑制凋亡的内源性生长因子及增加DNA修复能力的修复酶，例如聚合酶、多功能修复酶APEX等［20］。


4.表观遗传修饰：表观遗传修饰在受精后起着多重作用。已经证实，亲本基因通过CpG岛的S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移（S-adenosyl methionine， SAM）介导DNA甲基化，对子代的基因印记产生影响。SAM酶在小鼠或人类胚胎基因组激活前合成。SAM水平可被内源性的甲硫氨酸所干扰，SAM合成的抑制或内源性甲硫氨酸的不足可以改变基因激活的进程，并影响胚胎发育和凋亡［21］。具体机制为甲硫氨酸和半胱氨酸通过转硫酸基途径影响谷胱甘肽及谷胱甘肽相关酶的活性，而谷胱甘肽恰恰是抵抗活性氧（reactive oxygen species， ROS），抑制凋亡的主要因子，因此，甲硫氨酸的不足可通过含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶依赖或非依赖途径导致细胞死亡。毋庸置疑的是，在OT过程中，外源卵胞质可能会对卵母细胞表观遗传造成影响，通过卵裂球碎片及凋亡调控作用于早期胚胎发育。Liang等［22］建立小鼠模型，采用C57BL/6和DBA/2分别对供体卵胞质和受体卵胞质染色，研究OT是否会带来父源性基因功能的改变。结果显示，OT可显著影响父源性的基因表达。此外，研究证实对卵母细胞进行显微操作处理，也会对早期小鼠胚胎的基因表达产生影响，进而导致表观遗传修饰的改变。例如，核移植过程，可导致主要尿蛋白（major urinary proteins， MUP）及嗅觉标记蛋白基因甲基化或表达抑制，造成小鼠体质量的减少。令人不安的是，这种获得性表型绝大多数可以传递给子代［23］。


5.线粒体功能：卵子质量差导致IVF治疗失败的患者，也可能是由于能量产物不足导致的。健康的线粒体是受精过程中细胞凋亡信号通路、正确染色体分离，以及后续有丝分裂所需ATP产生的场所。OT可以通过供体健康线粒体的补给，改善受体胚胎发育及染色体分离异常的问题。研究证实，发育好且容易种植的胚胎，需要每枚卵子的ATP含量≥2 pmol，而卵胞质线粒体的缺乏，可增加诱导细胞凋亡的程度，最终导致细胞碎片多，胚胎发育阻滞［4］。Wilding等［24］研究显示，线粒体缺陷与胚胎嵌合体的发生有关。El Shourbagy等［25］对不成熟猪卵子注射来自成熟卵子的线粒体悬液，结果显示，研究组的受精率及胚胎存活率均较未注射组高，IVF受精率由17.6%提高到31%，ICSI的受精率由19.8%提高到34%，此外，线粒体在卵胞质内起到平衡促进与抑制凋亡因子的作用，同时还能使氧化应激处于稳态。Liu等［26］报道，卵母细胞被H2O2处理后，将OT重构胚组和对照组进行TUNEL染色。实验结果显示，研究组与对照组相比，卵裂率、桑葚率、囊胚率有显著提高，胚胎凋亡率显著降低，说明健康的胞质可以某种程度上挽救因氧化导致胚胎细胞凋亡的程度。


6.mRNA： 胚胎基因组激活（人类为4~8-细胞）之前，胚胎发育几乎唯一能依靠的是卵子成熟积累下来的母源mRNA、蛋白质及内容物［27］。此外，大量核移植和体细胞克隆研究证明，早期胚胎发育关键节点及事件，如原核形成、首次卵裂、母源基因启动、胚胎致密化、DNA甲基化、自噬和凋亡等，均受母源基因调控。有些母源因素甚至持续到胚胎基因组激活之后，影响着床前胚胎发育［28-29］。卵胞质缺陷可能是反复无可移植胚胎患者辅助生育失败的直接原因之一。


母源性的mRNA翻译负责早期卵裂、受精卵控制以及胚胎基因激活的作用。细胞质多腺苷酸化是募集母源mRNA的分子机制，作为细胞质多腺苷化成分的mRNA 3’端非翻译区特异的核苷酸序列将poly聚合酶添加到mRNA上。使得多腺苷酸化的mRNA与多聚核糖体、序列翻译、编码蛋白水平的增加之间发生联系［30］。其中，受poly聚合酶保护的Oct-4、connexin-32、connexin-34的mRNA转录是早期分化、全能性、囊胚形成的重要要素。卵胞质移植中注入的供体细胞质，可增加部分聚合酶、细胞质多腺苷酸化联接蛋白（cytoplasmic polyadenylation element binding protein， CPEB）、卵裂多腺苷酸化特异因子（cleavage and polyadenylation specific factor， CPSF）的含量，对于改善有缺陷的卵子是有益的［31］。


三.结论与展望


虽然OT技术可以帮助质量差的卵母细胞或胚胎恢复正常的受精及发育能力，但若要将该技术广泛推广到临床应用，仍需要对受体的线粒体功能、细胞凋亡的调节、细胞分裂、表观遗传修饰、卵胞质内容物、mRNA等方面的影响进行深入研究。此外，目前缺乏一个客观的生物学标志物鉴定卵母细胞的发育情况，如何鉴定及定义合适的卵母细胞作为供体卵胞质，外源注入的卵胞质是否对胚胎的发育存在远期影响等诸多问题仍需探究。值得欣喜的是，目前主流自体线粒体移植的研究，供体和受体的遗传物质一致，巧妙地规避了“三亲”伦理问题。相信随着技术上的改进及建立标准，会逐渐解决OT存在的问题，为辅助生育中质量差的卵母细胞提供转化为健康卵母细胞的路径。


参考文献（略）