性发育异常患者除了有器质性病变外,精神上亦有莫大的痛苦和严重的创伤。正确的诊断和处理此类病例使他们能过上正常人的生活十分重要。而单纯靠临床表现和普通细胞遗传学检查往往不能确诊。因此,先进的诊断技术的建立是确定诊断、选择治疗方案、指导优生咨询、预防患儿出生的关键。本研究在细胞遗传学基础上,应用荧光原位杂交(fluorscence in situ hybridization.FISH)和聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,对275例性发育异
常患者中的6例疑难患者进行了分析研究。
资料与方法
一、研究对象
本组病例来源于来我院门诊及住院患者共275例。
二、方法
(一)细胞遗传学分析
(二)FISH
1.预杂交 取真空抽干的DNA100ng,加杂交液10μl,于75℃变性5分钟,立即置于0℃ 5分钟。
2.标本变性 杂交标本于50℃烤片至少2小时,标本置于72℃ 70%甲酰胺/2× SSC变性2分钟,立即按顺序经70%,90%和100%冰乙醇,脱水各5分钟,室温干燥。
3.原位杂交 将预杂交的DNA探针滴于上述处理的染色体玻片标本上,盖上玻片,Rubber- Cement封片,置潮湿暗盒中37℃杂交过夜。
4.信号的检测与放大,用生物素标记的探针杂交标本于42℃经50%甲酰胺/2× SSC漂洗4次各5分钟,1× SSC漂洗3次各5分,用150μl 4× SSC/3%BA S/0.1 Tween20封闭,37℃温育15分,加100μl avidin- FITC于37℃温育30分钟。经过4× SSC/3% BAS/0.1% Tween20于42℃洗涤
3次各5分,再4× SSC/3% BAS/0.1%Tween20/5% GoatSevum封闭。以Anti- avidin和再次辅加avidin- FITC进行信号放大,玻片用PI/Antifade复杂。
5.用荧光显微镜观察杂交信号和染色体情况并照像记录。
(三)PCR方法下的SRY基因检测
1.外周血细胞DNA模板制备
2.SRY引物和PCR扩物
SRY引物序列P 5′ CATGA ACGCA TTGAT CGTGTGGTC 3′和m5′CTGCG GGAAG CAAAC TGCAA TTCTT3′扩增片段的长度为254bp。
结果
一、细胞遗传学检查
275例临床表现性发育异常者进行性染色质筛查、普通染色体G显带、C显带、高分辨染色体、迟复制染色体等细胞遗传学分析所得结果:染色体核型正常者共208例;染色体异常共67例,包括染色体数目异常55例,染色体结构异常12例。
二、FISH和PCR技术检测
275例患者中有4例临床表型与染色体核型不相符,2例染色体结构异常难以辨认,对此6例又进一步使用FISH和PCR技术分析如下:
例1:女性,9岁,外生殖器异常,查体外阴似男性型,阴茎长度与14岁正常男孩相仿,尿道下裂,外阴处无阴囊和睾丸,肛查盆腔内未触及睾丸,CT检查发现始基子宫。染色体G显带核型46,XX;FISH检查用PY3.4探针进行地杂交无绿色荧光信号;PCR分析正常3男性对照中254bp处有一条清晰的SRY扩增带,女性对照及患者未出现此带。
例2:女性,是例1患者的双胞胎妹妹,症状与例1患者相似,染色体G显带核型46,XX;FISH检查用PY3.4探针进行杂交无绿色荧光信号;PCR分析第一次实验在254bp处有一模糊扩增带,经反复几次实验未再出现此带,证实患者确无SRY基因扩增带。
例3:男性29岁,无精子,查体第二性征正常,双睾丸小于正常。染色体G显带分析核型为45,X。FISH采用PY3.4探针无绿色荧光信号。PCR检测到特异性SRY扩增带。
例4:男性25岁,无精子,查体正常男性表型。染色体G显带分析核型为46,XX。FISH采用PY3.4探针无绿色荧光信号,PbamXz探针发现每个核型中有两个荧光信号。PCR检测到特异性SRY扩增带,诊断为性反转综合征。
例5:女性18岁,原发闭经,查体外阴发育差,阴蒂略大似花生米大小,阴道呈盲端,未触及子宫及腹股沟包块。超声检查有睾丸组织回声。染色体G显带分析每个细胞有46条染色体,两个6号染色体相比,其中一个正常,另一个比正常6号染色体长1/6- 1/7;其短臂2区1带以远结构异常。
考虑是Y物质,做染色体C显带分析异常部分呈深染。FISH采用PY3.4探针进行杂交,可见其短臂远端呈绿色荧光信号。PCR分析有明显的SRY特异扩增带。确定核型为46,X,t(Y;6)(Yqter※Yq11∷ 6p21.3※6qter)。例6:男性40岁,无精症,查体正常男性型,染色体G显带分析数目是46条染色体,22对常染色体正常,一对性染色体中有一条正常X染色体,未见Y染色体,但多一条中着丝粒染色体,两臂无明显带纹,染色体C显带两端深染(见图1)。又进一步做FISH,采用PY3.4探针杂交发现双臂远端显示强的绿色荧光,证实核型是46,X,t(Y;Y)(pter※p11∷ q11※qter)(见封三图 )。PCR分析有特异SRY扩增带。见图3。
讨论
一、性发育异常诊断新技术
本研究中的275例患者有269例通过G显带得到染色体核型确诊。对于Y染色体不易判断时可采用C显带,它是可显示着丝粒和Y染色体长臂。然而,普通显带技术对于标记染色体和微小染色体断片及复杂的结构异常难以准确识别。对疑难病例可应用FISH和PCR检测[1]。本文中即有两例使用显带技术无法确定核型,分别为6号染色体短臂2区1带远端模糊和多一条无明显带纹的中着丝粒染色体。G显带、C显带不能确定。但应用FISH和PCR定位,结果准确直观,确定了核型分别为46,X,t(Y;6)(Yq11※Yq11∷ 6q21.3※6qter)和46,X,t(Y;Y)(pter※p11∷ q11※qter)。FISH是应用染色体特异性基因为探针,与中期染色体或间期核进行荧光原位杂交,从而可显示相应染色体或某一特定区域。在中期分裂相时即使500bp靶序列也可被识别,故可对微小片段或复杂结构异常作出诊断[2- 3]。且由于能与间期核杂交,使原来培养7- 10天的实验缩短至2天即可完成。FISH能十分精确地判断核型,是在显带染色体上直接观察杂交信号的新的定位方法。目前,这一工作逐步开展,国外Evans[4]用X染色体上的粘粒contig探针和粘粒克隆Y探针与49例未培养绒毛间期核内染色体DNA荧光原位杂交,结果发现女性核型中95.3%观察到X探针杂交信号,男性核型中,X探针杂交信号97%,Y探针杂交信号95.5%,显示出杂交率高,结果快速准确。Ohto[5]及夏家辉等[6]运用此技术对细胞遗传学不能做出诊断的异常染色体来源进行鉴定,明确了来源。黄浩杰等[7]用FISH分析染色体复杂易位。利用特异性探针可与染色体上任何片段杂交,促进了染色体结构基因作图。随着YOYO染料的使用fiber FISH问世,人们直观看到DNA分子图象,这为性发育异常的基因研究提供了手段。
尽管FISH的出现解决了微小染色体片段来源、复杂结构异常和间期核染色质数目异常的诊断问题。但有时不能对性反转和真两性畸形其他混合性性腺发育不全染色体核型与临床的矛盾作出满意的解释,如本文45,X和46,XX男性性反转本是女性核型却具有男性性征。作者采用FISH和SRY- PCR相结合的方法对此类患者进行检测,解释了核型与临床不符的问题。SRY- PCR结果显示有SRY特异杂交带,说明患者虽无Y染色体结构,由于有SRY基因存在导致在胚胎性别决定过程中发育成男性。双胞胎姐妹外生殖器有阴茎的异常发育,超声发现有子宫无睾丸,染色体核型为46,XX,SRY- PCR分析未发现SRY基因的存在。目前尚无双胞胎均为性发育异常患者的报道,且其母孕期无药史。这证实性别分化发育中SRY起决定性作用,但还有其他环节因素参与。
二、性发育异常的早期诊治和预防
本文建立FISH和PCR等新技术,为诊断性发育异常患者提供新的检测手段。将细胞遗传诊断水平提高到分子细胞学和分子遗传学诊断水平。指导临床对相应患者选择合适的治疗方案;尽量减轻患者症状。对高危孕妇进行产前诊断,早期应用绒毛或母血中的胎儿细胞及妊娠中期羊水细胞进行FISH和PCR- SRY基因筛选异常胎儿。避免异常患儿出生,达到优生目的。
参考文献
[1]Cho N H,et al.SRY gene detection in gonads of intersex patients using FISH.J Korean Med Sci,1997,Jun.12(3):204.
[2]Dauwerse J G.et al.Detection of chromosome aberrations in metaphase and interphase tumor cells by in situ hybridization using cosmid clones.Cytogenet Cell Genet,1990,53:126.
[3]Pinkle D,et al. Fluorescence in situ hybridization with human chro-mosome specific libaries:detection of trisomy 21 and translocations of chromosome 4.Proc Natl Acad Sci USA,1990,85:9138.
[4]Evans M I,et al.Am J Obstet Gynecol,1992:1522- 1524
[5]Ohto T,et al.The origin of cytologically unidentifiable chromosome abnormalities:Six cases ascertained by targeted chromosome- band painting.Hum Genet,1993,89(1):1.
[6]夏家辉,等.11号染色体探针池的应用.中华医学遗传学杂志,1994,11(3):168.
[7]黄浩杰,等.应用G显带荧光原位杂交(FISH)技术研究复杂的染色体易位.遗传学报,1996,23(5):388- 392.
