性发育异常( disorder of sex development，DSD) 是一种先天性的染色体性别、性腺性别和生殖器解剖性别发育不典型的疾病，通常分成性染色体DSD、46，XY DSD 和46，XX DSD三大类型，一般发病率为1‰ ～ 3‰［1，2］。性发育异常的主要由染色体异常和基因突变导致，所以染色体核型分析是性发育异常患者必须检查的项目之一，但是染色体核型分析不能很好地检查出染色体的微小缺失和重复，因此本文采用荧光原位杂交和微阵列比较基因组杂交技术分析一例性发育异常患者的染色体畸变，以探讨可能的遗传学发病机制。
1 对象和方法
1. 1 对象: 患者，社会性别女性， 20 岁，从无月经来潮就诊，体查: 身高150. 0cm，体重47kg，乳头未发育，乳晕色苍白，双侧腹股沟可触及两个拇指大小类似睾丸样组织，女性外阴，有大小阴唇，阴蒂增大，无阴毛、腋毛，无阴道外口。性激素六项: 睾酮( TESTO) 0. 13μg /L，孕酮( PROG) 0. 61 g /L，雌二醇( E2) 20 pg /ml，泌乳素( PRL) 12. 36 μg /L，促黄体生成激素( LH) 28. 74 IU/L，促卵泡生成激素( FSH) 118. 27 IU/L。经腹子宫及附件彩超: 未见子宫及两侧卵巢形态轮廓，也未见阴道气体线，考虑先天性无子宫和无阴道。
1. 2 方法:
1. 2. 1 染色体G 显带核型分析: 经患者及家属知情同意后，取患者及其父母静脉血，常规方法对静脉血进行细胞培养、收获及制片，GTG( G － bands by Trypsin using Giemsa) 显带，
核型分析，根据《人类细胞遗传学国际命名体制ISCN( 2009) 》确定染色体核型。
1. 2. 2 DNA 提取: 使用Gentra Puregene 试剂盒( 美国Qiagen公司) 提取外周血基因组DNA。Nanodrop 分光光度计( 美国Themo Fisher Scientific 公司) 检测DNA 质量及浓度。琼脂糖
凝胶电泳验证。
1. 2. 3 荧光原位杂交: 应用Vysis SRY Probe LSI SRY Spectrum Orange /CEP X Spectrum Blue /DYZ1 Probe LSI DYZ1Spectrum Green( Vysis /Abbott，Abbott Park) 试剂盒( 探针分别
定位于Yp11. 31、Xp11. 1 － q11. 1 和Yq12) ，对间期细胞及中期分裂相进行检测，杂交及洗片条件均参照试剂盒说明操作。
1. 2. 4 微阵列比较基因组杂交: 应用Agilent 01igonucleotide array 180K 平台，RsaI － AluI 消化、Cy3 － Cy5 标记及杂交等反应均参照Agilent Human Genome CGH microarray 180K 试剂盒说明进行。芯片经Agilent DNA Microarray Scanner( G2565AA) 扫描后，应用程序Feature Extraction，CGH Analytics(美国Agilent Technologies 公司) 分析数据。芯片序列信息来源于March 2006 Assembly( NCBl36 /h918) of the UCSCHuman Genome browser( http: / /genome． UCSC． edu /) 。
2 结果
2. 1 染色体G 显带核型分析结果
    患者G 显带核型分析: 45，X0 ［30］/ 46，XY，der( Y) ( 见图1) ，患者父母G 显带核型分析结果无明显异常。
2. 2 荧光原位杂交结果
    可见两种细胞核，一种仅有蓝色X 信号，另一种出现一个红色SRY 信号、一个蓝色X 信号和两个绿色DYZ1 信号，SRY 信号位于衍生染色体中间区段，其两侧各有一个DYZ1信号( 图2 见封二) 。
2. 3 微阵列比较基因组杂交结果
    微阵列比较基因组杂交显示，一个XY 男性模式，存在Yq11. 21 － q11. 23 区域长14. 582 Mb 的重复片段( chrY:12611424 － 27193624，包括基因USP9Y 到PRY 基因) ( 见图3) 。
3 讨论
    人类性的发育和分化过程是一个非常复杂的连续而有序的过程，包括性别决定和性别分化两个过程。性别决定属于XY 型，即由性染色体XX 决定女性、XY 决定男性。而性别分化除与性染色体有关外，还与SRY 基因、SOX9 基因、SF1 基因、WT1 基因和DAX1 基因等诸多基因有关［3，4］。在此过程中，任何一个性别发育和分化环节受到不良因素的影响，将会导致性发育异常( DSD) 。在本研究中，1例性发育异常患者经过常规染色体G 显带核型分析，初步发现染色体核型为染色体数目异常及嵌合体45，X0 /46，XY，der( Y) ，然后采用SRY 基因探针、着丝粒CSPX 染色体特异重复序列探针和DYZ1 序列探针进行荧光原位杂交，进一步确定嵌合体的一部分细胞核型为45，X，另一部分细胞中的Y 染色体存在一个SRY 基因和Yq12 区域DYZ1 序列的二倍体重复片段，最后应用微阵列比较基因组杂交技术，初步发现Y 染色体含有Yq11. 21－q11. 23 区域长14. 582 Mb 的重复片段( chrY: 12611424－27193624，包括基因USP9Y 到PRY 基因) 。综合以上结果分析，该性发育异常患者45，X0 嵌合体核型中的Y染色体存在异常结构，这条新发生衍生Y 染色体结构为Yqter→Yq11. 21: : Yp11. 31→Yqter。鉴于该性发育异常患者父母染色体核型分析结果正常，不大可能产生异常的配子，推测此DSD 患者异常核型产生的遗传学机制如下: 最初受精卵细胞是正常的，在正常受精卵进行第一次有丝分裂后期，一套Y 姊妹染色体不分离，形成一个X0 单体细胞和另一个XYY 三体细胞，然后三体细胞中一条Y 染色体在Yp11. 31 断裂，另一条Y 染色体在Yq11. 21 断裂，同时这两条Y 染色体间发生相互易位，重组形成两条衍生Y 染色体，其中一条衍生Y 染色体丢失了，另一条Y 染色体( Yqter→Yq11. 21: : Yp11. 31→Yqter) 保存下来继续参与有丝分裂过程，最终形成异常染色体嵌合体核型45，X0 /46，XY，der( Y) t( Y; Y) ( p11. 3; q11. 21) 。此性发育异常患者一部分细胞中只含有45 条染色体，缺少了一条Y染色体，其它大部分细胞中具有一条新发生的异常衍生Y 染色体，含有Yq11. 21 － Yqter 区域较长的二倍体重复片段，虽然还存在一个SRY 基因，但是这些Y 染色体的缺失和大片段重复，仍然足以影响该患者正常的性别发育和分化过程，导致患者激素水平异常和睾丸组织发育不良。
    传统染色体显带技术可以为衍生染色体的来源和结构提供大致方向，但受自身分辨率所限，对衍生染色体的来源、畸变片段的大小、断裂点等信息不能给出准确的判断。FISH技术应用荧光标记的DNA 探针与待测样本的中期或间期细胞杂交，可以发现及定位样本的特异基因片段，推测异常染色体的来源、估计嵌合比率等，但信息量少，不够准确。微阵列比较基因组杂交技术( Array － CGH) 与传统的比较基因组杂交技术原理相同，但是它的主要优势在于可以高分辨率覆盖人类基因组，能够检测任一DNA 含量的变化，能够在基因组水平提供基因的量化信息，可检测染色体微小缺失或重复发生的位置、片段大小以及涉及到的基因，但是不能判断染色体重组后片段间的位置结构关系。因此对于染色体结构异常且为嵌合型的病例，应在染色体显带技术基础上，再采用FISH 和Array － CGH 等技术进行进一步检测，有助于其遗传发病机制与临床效应的研究，并可深入指导临床遗传咨询，值得临床推广应用。
    致谢: 本文荧光原位杂交分析和Array － CGH 分析承美国耶鲁大学医学院细胞遗传实验室李培宁教授指导和支持，
特此感谢。
参考文献
［1］Hughes IA，Houk C，Ahmed SF，L ee PA． Consensus statement on management of intersex disorders ［J］． Arch Dis Child，2006，91∶ 554－ 563.
［2］Lee ＆ PA． Consensus statement on management of intersex disorders．International Consensus Conference on Intersex［J］． Pediatrics，2006，118∶ e488 － 500.
［3］Kojima Y，Hayashi Y，Mizuno K，et al． Up － regulation of SOX9 in human sex － determini ng region on the Y chromosome( SRY) － negative XX males ［J］． Clin Endocrinol ( Oxf) ，2008，68( 5) ∶ 791 － 799.
［4］Philibert P，Leprieur E，Zenaty D，et al． Steroidogenic factor － 1( SF－ 1) gene mutation as a frequent cause of primary amenorrhea in 46，XY female adolescents with low testosterone concentration［J］． Reprod Biol Endocrinol，2010，8∶ 28.