性发育异常是一种先天遗传性异常，通常表现为染色体、性腺和性解剖结构不典型，一般发病率为1‰～3‰，根据其定义性发育异常可分为3 个类型: 性染色体、46，XX 和46，XY 发育异常［1－2］，其发病机制不详。目前越来越多研究表明，性别的决定和分化，是由SRY( sex－determining region Y) 基因主导，其它性别相关基因如编码转录因子的SOX9 基因、DSS 基因、DAX－1 基因、NR5A1 基因及编码细胞信号分子的WNT4 基因、CYP21A2 及CYP21A1P 基因等多种基因共同参与和调控的复杂过程。本文分析了3 例46，XX 男性性反转综合征及1 例女性假两性畸形患者的临床特点，并采用多重连接依赖的探针扩增( multiplex ligation － dependent probe amplification，MLPA) 技术对患者SRY、DSS、DAX1、WNT4、SOX9、NR5A1、CYP21A2 等性别相关基因拷贝数进行筛查，最终采用荧光原位杂交技术( fluorescent in situ hybridization，FISH) 进行基因定位，对性发育异常患者进行了细胞及分子遗传学研究，从遗传学角度进一步分析性发育异常机制。发育异常机制。
材料和方法
1 临床资料
选取2010 年12 月份至2011 年4 月份来我院就诊的3 例男性性反转综合征患者，临床均表现为无精子症、不育; 染色体核型分析均为46，XX。1 例女性假两性畸形患者，由于其已死亡，故选择其父母作为先证者进行性别相关基因分析。
2 方法
2．1 MLPA 检测与分析
2．1．1 MLPA 检测采用SALSA P185－B2 试剂盒( 购自MRC Holland) ，SALSA 试剂盒包括的探针包括: NR0B1、SRY、SOX9、DAX1、WNT4、NR5A1、CYP21A2、CYP21A1P 及X、Y 染色体特异性基因探针，有6 个参考基因探针以检测不同的常染色体基因定位。MLPA 操作过程按照说明书进行，50 ngDNA 在98 ℃变性5 min，然后和SALSA 探针混合物混匀；60 ℃ 杂交过夜后，用连接酶( Ligase－65) 54℃连接15 min，再98 ℃孵育5 min 终止反应，最后使用SALSA FAM PCR 体系进行PCR 扩增。取PCR 产物1 μL 应用ABI3100 测序仪进行片段分析，每次反应均以正常男性标本作为对照，所得数据采用Gene-Marker 1．8 软件进行处理，以正常男性的数据为对照，计算片段扩增或缺失的情况。
2．1．2 MLPA 结果分析及确证方法根据MLPA 探针混合物中的引物序列捕获片段大小不一的DNA区域，通过毛细管电泳并检测，获得不同片段迁移的相对位置的图像和数据。GeneMarker 1．8 软件通过对这些位置上出现的峰面积进行标化和对比，获得单个样本的每一个峰面积数值。患者待测基因拷贝数与正常男性基因拷贝数比较得出结果: 当患者待检测基因位点存在时其峰值面积比介于0．75～3．00之间；当患者待检测基因位点不存在时，其峰值面积比小于0．75；当患者待检测基因存在双拷贝时，其峰值面积比大于1．30［3］。
2．2 FISH 探针制备及杂交X、Y 染色体购自Cytocell，分别为青色和绿色荧光。SRY 基因FISH 探针采用细菌人工染色体( bacterial artificial chromosom，BAC) 克隆按照切口平移法标记红色荧光［4］。FISH细胞制片按照常规的方法进行，细胞标本经消化、低渗后进行固定，滴片数张，烤片2 h 后经梯度乙醇脱水后在选定区域滴加0． 01 mL 的探针混合液、封片；将玻片置入杂交仪内，变性及杂交过夜; 洗涤液洗涤后梯度乙醇脱水、DAPI 复染、阅片。结果观察在荧光显微镜下进行，根据DAPI 显带的情况判断染色体来源、上述信号位于染色体的位置。分别观察20 组中期分裂相，判断红色、绿色与青色荧光信号的数目及所处的染色体［4］。
结果
1 性反转综合征检测结果
3 例性反转综合征患者社会性别均为男性，染色体核型均为46，XX，经MLPA 基因筛查均发现存在单拷贝SRY 基因，DSS、DAX1、WNT4、SOX9、NR5A1等性别相关基因数目未见异常。FISH 技术鉴定存在2 条X 染色体，SRY 基因易位于其中1 条X 染色体的短臂上。
2 女性假两性畸形检测结果
女性假两性畸形患者母亲及父亲临床表现无特殊，母亲染色体核型为46，XX，MLPA 基因筛查发现CYP21A2－ex03 杂合性缺失，CYP21A1P－ex02 杂合性重复，DSS、DAX1、WNT4、SOX9、NR5A1 等性别相关基因未见异常; 父亲染色体核型为46，XY，MLPA 基因筛查发现CYP21A2－ex01 和CYP21A2－ex03 杂合性缺失，CYP21A1P－ex02 和CYP21A1－ ex10 杂合性重复，DSS、DAX1、WNT4、SOX9、NR5A1 等性别相关基因未见异常。
3 MLPA 检测结果
图1 为46，XX 男性性反转综合征患者MLPA 的验证结果，图中可见Xq22、Xq13、Xp22 和Xp11 所对应片段在3100 电泳图上的荧光峰面积分别为1. 774、1．513、1． 532 和1．593，表示与正常男性对照相比，待测样本存在双拷贝X 染色体，即XX; Yp11( SRY) 所对应片段的荧光峰面积为0．930，表示与正常男性对照一致，不存在缺失或重复，即SRY( + ) ；Yq11 所对应片段的荧光峰面积为0． 000，表示与正常男性对照该位点的荧光峰完全缺失; NR0B1 基因的2 个第一外显子所对应片段的荧光峰面积分别为1．778 和1．798；第二外显子所对应片段的荧光峰面积为1． 655，表示与正常男性对照相比，待测样本存在双拷贝片段。DSS、DAX1、WNT4、SOX9、NR5A1 等性别相关基因未见异常。
图2 为女性假两性畸形患者母亲的MLPA 验证结果，图中可见CYP21A1P－ex02 所对应片段在3100 电泳图上的荧光峰面积为1．535，表示与正常女性对照相比，待测样本存在CYP21A1 杂合性重复。CYP21A2 － ex03 所对应片段的荧光峰面积为0．512，表示与正常女性对照相比，待测样本CYP21A2 基因杂合性缺失。DSS、DAX1、WNT4、SOX9、NR5A1 等性别相关基因未见异常。
图3 为女性假两性畸形患者父亲的MLPA 验证结果，图中可见CYP21A1P－ex02 和CYP21A1P－ex10 所对应片段在3100 电泳图上的荧光峰面积分别为1．685 和1．501，表示与正常男性对照相比，待测样本存在CYP21A1P 杂合性重复; CYP21A2－ex01和CYP21A2－ex03 所对应片段的荧光峰面积分别为0．644 和0．523，表示与正常男性对照相比，待测样本CYP21A2 基因杂合性缺失。DSS、DAX1、WNT4、SOX9、NR5A1 等性别相关基因未见异常。
4 FISH 结果
图4 为其中1 例46，XX 男性性反转综合征患者的X/Y/SRY 染色体图染分析FISH 的验证结果，3例患者的中期细胞分裂相上均可以看到2 条X 染色体(绿色) 及1 条红色荧光探针信号，其中红色荧光探针信号与绿色的X 染色体着丝粒探针位于同一条染色体上，从位置上判断其位于短臂上。
讨论
性分化与性发育是一个复杂的过程，人类性别分化主要是由性染色体决定的，其中Y 染色体在性别决定中起主导作用，而睾丸分化又是性别决定的关键所在。研究表明SRY 基因定位于Yp11． 23，该基因的获得或缺失会引起性发育异常。但许多研究显示并不是每个性发育异常患者都能以SRY 基因的存在或缺少、正常或异常来解释，性别决定是以SRY基因为主导，多个性别相关基因共同参与协调的结果。故常规检测SRY 基因，并不能深入探讨性发育异常患者的发病机制［5］。以往只能应用PCR 技术对单个性别相关基因逐一进行研究，本研究应用了MLPA 技术，可在同一个反应体系中同时检测多个性别相关基因的拷贝数的变化，对其性别相关基因进行拷贝数筛查。本文在前人研究性发育异常发病机制基础上，对性发育异常患者先进行染色体核型分析鉴别染色体性别，之后利用MLPA 技术在同一个反应体系中同时检测SRY、DSS、DAX1、WNT4、SOX9、NR5A1、CYP21A2 等性别相关基因拷贝数变化的优点，对其性别相关基因进行拷贝数筛查，然后选择异常基因片段进行荧光标记定位，进一步探讨性发育异常的发病机制。
1 46，XX 男性性反转综合征
46，XX 男性性反转综合征患者染色体核型为女性，但表型及性腺为男性，又称为De La Chapelle 综合征，其发病率在男性中为1∶ 20 000～1∶ 25 000［6］。在临床上可分为SRY 基因阳性及SRY 基因阴性患者，SRY 基因阳性者约占85%～90%。关于46，XX 男性性反转综合征可能的发病机制有多种学说，其中大多研究表明Xp － Yp 易位假说占主导地位，即父系精子减数分裂过程中发生X－Y 染色体末端异常交换( Xp－Yp 易位) ，导致含SRY 基因的X 型精子产生，当其与卵子结合则可能导致子代46，XX 男性产生。
如本文3 例患者MLPA 检测到均含有2 条X 染色体，且性别决定基因SRY ( + ) ，X/SRY FISH 检测SRY 基因定位在X 染色体短臂末端，证实了Yp－Xp末端交换假说。目前，用分子杂交技术及PCR 技术已证实了大部分46，XX 男性患者某一X 染色体末端存在Y 染色体片段［7］。但是46，XX 男性性反转综合征患者在临床表现上却有较大的异质性，SRY基因阳性者主要表现为青春期后不育、睾丸发育差等问题，但外生殖器发育正常，在青春期前与正常男性几无明显区别，故在青春期前不易被发现; SRY 基因阴性者，其发病机制并不清楚，临床上主要表现为外生殖器异常，典型的表现为尿道下裂，可在出生后不久发现异常［8］。
2 女性假两性畸形
女性假两性畸形发病率约为1 /40 000，其核型为46，XX，性腺是卵巢，有子宫和阴道，外阴表现两性畸形。最常见原因为先天性肾上腺皮质增生( congenital adrenal hyperplasia，CAH) ，呈常染色体隐性遗传。其最主要的发病机制是21－羟化酶( 21－hydroxylase，CYP21) 基因突变引起肾上腺皮质无法将17－羟孕酮转化为皮质酮; 后者合成减少时，对丘脑下部和垂体前叶的正常反馈消失，导致促肾上腺皮质激素增加而刺激肾上腺增生，使分泌的皮质酮趋于正常，同时也刺激肾上腺网状带产生大量雄激素，使女婴出现男性化表型，表现为女性假两性畸形，而男性则表现为性早熟［9］。由于本实验室此例患者已死亡，其母亲再次妊娠，现孕20 周，来我实验室行产前诊断。对其父母进行性别相关基因检测，发现其母亲CYP21A2－ex03 基因杂合性缺失，CYP21A1P－ex02 基因杂合性重复; 父亲CYP21A2－ex01 和CYP21A2－ex03 杂合性缺失，CYP21A1P－ex02 和CYP21A1P－ex10 杂合性重复。
在临床工作中如发现以生殖器发育异常、成年男性患者不育等为主诉的患者，不仅要进行SRY 基因分析，还应该对其它性别相关基因如SOX9、CYP21A1P、CYP21A2 等进行分析，要在细胞遗传学检查的基础上，进行分子遗传学检测，有利于从基因水平揭示性别发育异常的原因，可为患者的临床诊断、治疗提供更好的依据。同时，产前诊断对于预防性发育异常缺陷儿的出生具有一定的意义，当产前超声与细胞遗传学结果不一致时，需对胎儿进行产前诊断。
参考文献
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